Основы генетической инженерии

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума–Джилберта). Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн – Хогнесс) . (рис. 4).

Рис. 4. Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов.

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. shotgun – дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.

Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) . Теперь специфическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).

После расщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразу E.coli – фрагмент Клёнова, синтезируют двухцепочечную ДНК.

После расщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК, соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клетках прокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии соответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементам бактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.

На современном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидных последовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году в лаборатории Х.Г. Кораны.

Рис. 5. Схема подготовки кДНК для клонирования.

Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомиценами и Sacchromyces cerevisiae.

Еще по теме:

Особенности коррекционной работы по развитию сенсорных эталонов у детей 7-го года жизни с нарушением зрения в дидактических играх и упражнениях
В подготовительной к школе группе рекомендуется дальнейшее усложнение заданий на анализ цвета, формы и величины предметов. Продолжается усвоение детьми оттенков цвета по светлоте, вводятся тонкие градации таких оттенков (до четырех – пяти). Впервые дошкольники знакомятся с оттенками по цветовому то ...

Использование современных педагогических технологий при изучении творчества Ю. Кузнецова
Однако, как показывает практика и анализ учебных программ, литература, охватывающая последнее десятилетие, в школьном изучении представлена очень мало: как правило, большей частью это проза, и то, в основном, в обзорных курсах. Сокращение академических часов по литературе еще более усугубляет ситуа ...

Тематическое планирование элективного курса «Основы биотехнологии»
1. Биотехнология. Биотехнологические процессы в пищевой промышленности. 2. Биотехнологическая переработка отходов. 3. Бактериальное выщелачивание. 4. Основы получения БАВ. Производство кормового белка. 5. Производство аминокислот, витаминов и антибиотиков. 6. Применение ферментов. 7. Практическая р ...

Категории

• Главная
• Обучение детей ориентировке во времени
• Половое воспитание детей и подростков
• Ценности и воспитание
• Работа социального педагога
• Предмет и задачи педагогики
• Теоретические основы воспитания
• Информация о педагогике и образовании
• Карта сайта
• Контакты